代謝相關(guān)脂肪性肝�。�MASLD）波及全球超過30%人口，它不僅已成為導致終末期肝病的主要因素，還與多種慢性、系統(tǒng)性疾病（包括癌癥、心血管疾病和腎功能障礙）密切相關(guān)。MASLD在組織學上表現(xiàn)為從單純脂肪變性到脂肪性肝炎，再到進行性瘢痕形成（即疾病的不同分期）。MASLD的病情發(fā)展過程極為復雜。目前，阻止其病情進展的治療方法效果有限。因此，科學家們正在能夠早期發(fā)現(xiàn)脂肪變性的生物標志物，為預防MASLD提供更加科學的依據(jù)。盡管缺乏組織活檢這一參考金標準，但通過大型隊列研究和先進的成像技術(shù)，以及血液中的基因組和非基因組生物標志物，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了一些有潛力的早期生物標志物，如PNPLA3。然而，單憑基因變異并不能完全解釋行為和環(huán)境因素（如飲食、肥胖和糖尿�。⿲χ咀冃缘挠绊憽＿@些因素在更接近脂肪變性的其他分子狀態(tài)中有所體現(xiàn)，如循環(huán)蛋白質(zhì)組學和肝組織圖譜。此外，肝臟活檢雖然常用于二級護理中檢測已確診的疾病，但在大型研究中，這種方法針對高風險人群既不道德也不實際。因此，建立一個轉(zhuǎn)化資源庫，將分子洞察力與大型隊列流行病學、現(xiàn)代肝臟成像技術(shù)以及臨床結(jié)果的力量相結(jié)合，對于識別預后生物標志物至關(guān)重要。這些生物標志物可能會成為下游機理研究和治療開發(fā)的目標。
在這項研究中，科學家們的目標是建立一個轉(zhuǎn)化醫(yī)學資源庫，用于研究人類的代謝相關(guān)脂肪肝疾�。∕ASLD）。他們通過分析大量人群的臨床蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)，并結(jié)合非侵入性測量肝臟脂肪變性的方法和肝臟組織的動態(tài)變化，試圖找到與MASLD相關(guān)的循環(huán)蛋白質(zhì)。研究團隊通過利用三個大型、前瞻性、跨國隊列（≈5,000人），覆蓋了廣泛的代謝風險人群，使用不同的非侵入性方法來測量肝臟脂肪變性，并識別出與疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)。他們評估了這些肝臟脂肪變性相關(guān)的蛋白質(zhì)組特征在更大規(guī)模樣本（超過26,000人）中對MASLD預后和相關(guān)臨床結(jié)果的影響。為了更深入理解這些生物標志物并增強其組織特異性，科學家們使用了肝臟芯片模型來監(jiān)測肝臟脂肪變性過程中細胞特異性轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的動態(tài)變化。他們的最終目的是驗證一種整合循環(huán)蛋白質(zhì)組、組織轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組以及人體模型的方法，是否能在人體肝臟的動態(tài)代謝過程中找到生理上合理的靶點，以期將臨床生物標志物的發(fā)現(xiàn)與肝臟的生物學緊密聯(lián)系起來。
本研究包括6個步驟，具體包括：（1）識別并驗證與“肝脂肪變性”相關(guān)的蛋白質(zhì)組（涉及三項前瞻性觀察研究，共4996名參與者），(2)探究該蛋白質(zhì)組與肝脂肪變性相關(guān)的臨床結(jié)果之間的聯(lián)系（對英國生物銀行的26,421名參與者進行了長達13.7年的中位隨訪），(3)分析組織來源和相關(guān)分子通路的特性，(4)在完整的MASLD活動和階段譜系中，研究編碼肝臟脂肪變性蛋白質(zhì)組的基因在人類肝臟中的表達模式，(5)明確這些基因在患有和未患有MASLD的人類肝臟中的細胞類型和空間分布，(6)在人源化肝臟芯片平臺上進行靶標測試，以觀察轉(zhuǎn)錄變化是否隨著脂肪變性的誘導而發(fā)生，并研究這些變化是否影響蛋白質(zhì)的合成。
整體研究策略圖
總體而言，科學家們的研究共納入了2,679名CARDIA研究參與者，但排除了那些可能患有繼發(fā)性肝病的參與者、肝功能異常或脂肪變性的潛在次要原因（即非MASLD）。
群體陣列研究基本特征
2、MASLD循環(huán)蛋白質(zhì)組和組織特異性
在對2,679名參與者的SomaScan 7k蛋白質(zhì)組學研究中，科學家們在推導樣本和驗證樣本中識別出與肝衰減相關(guān)的237個獨特蛋白質(zhì)（肝衰減越低，肝脂肪變性越嚴重）（見圖1A和1B）。研究發(fā)現(xiàn)，流行病學研究中的蛋白質(zhì)靶標在轉(zhuǎn)錄水平（圖1C）和組織蛋白質(zhì)組水平（圖1D）上的表達明顯富集，指明了與中央代謝過程（如碳、丙酮酸、氨基酸、鈣、鎂）有關(guān)的廣泛通路，碳、丙酮酸、氨基酸和碳水化合物代謝和纖維化（圖1E），包括已知和新出現(xiàn)的MASLD機制，例如氨基酸代謝（ACY18,12和FAH13）、酒精加工（如ADH1A14,15）和纖維化（圖1F）、氨基酸代謝（ACY18,12和FAH13）、酒精加工（如 ADH1A14,15）、果糖分解（ALDOB和SORD16）、膽汁酸和類固醇代謝（AKR1D117和AKR1C418,19）、糖代謝（FBP120）以及多底物解毒、中間代謝和纖維化（GSTA1,21 ASL,22和UGDH23）等。
為了進一步確定 MASLD潛在的核心介導因子，科學家們進行了相互作用（中心基因）分析，找出了與MASLD核心相關(guān)的基因（圖1F）。這些基因涉及肝細胞再生和纖維化調(diào)控的致病介質(zhì)（表皮生長因子受體25和IGF-126）、細胞凋亡調(diào)控（MET27）、炎癥介質(zhì)（CXCL2、28 CRP和SERPINE1）、 肝損傷的細胞外基質(zhì)反應（VTN29和ACAN30）、糖原代謝（PYGL31）和線粒體丙酮酸代謝（PKLR32和 PC33），以及其他一些胰島素敏感性和脂肪堆積的典型標志物（ADIPOQ和 INS）。這些結(jié)果表明，循環(huán)中的MASLD蛋白質(zhì)組主要來源于肝臟，并與肝臟變性中的典型代謝-炎癥-纖維化途徑有關(guān)。
圖1與肝臟脂肪變性有關(guān)的蛋白質(zhì)主要在肝臟中表達，并確定新陳代謝的途徑
科學家們在對年齡、性別、種族和體重指數(shù)進行調(diào)整后，建立了一個自適應肝衰減模型（以下簡稱為 “MASLD評分”）。在推導子樣本和驗證子樣本中，MASLD評分與肝臟衰減顯示出顯著的相關(guān)性（Spearmanρ = 0.69和0.56，圖2A），并且當驗證子樣本僅限于符合MASLD臨床標準的參與者時，MASLD評分依然表現(xiàn)出相似的相關(guān)性�？茖W家們發(fā)現(xiàn)，體重指數(shù)與MASLD評分之間存在一定的相關(guān)性（Spearmanρ = -0.27，p < 2.2× 1016），而年齡、性別、種族和酗酒的影響則相對較小。
接下來，科學家們進行了研究，以確定MASLD評分是否與臨床結(jié)果有相關(guān)性，特別是與心血管疾病、糖尿�。ǜ闻K脂肪變性已知相關(guān)）和MASLD本身的臨床結(jié)果。他們分析了英國生物庫（UK Biobank）中26,421名參與者的數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)MASLD評分與MASLD及相關(guān)代謝結(jié)果有廣泛的相關(guān)性（圖2D）。研究還表明除了全因死亡率和病因特異性死亡率（尤其是癌癥）之外，MASLD評分（評分越低，脂肪變越多）與慢性非酒精性肝病和糖尿病的發(fā)生油顯著關(guān)聯(lián)。即使在考慮了其他可能影響結(jié)果的因素（如肝酶AST、ALT和糖尿病指標A1c）后，這些關(guān)聯(lián)依然存在。在心血管和癌癥相關(guān)死亡率方面，競爭風險模型（Fine-Gray subdistribution hazard model）提供的估計值與病因特異性模型相似（心血管死亡率HR 0.96，95% CI 0.88-1.06；癌癥死亡率HR 0.90，95% CI 0.84-0.97）。在糖尿病和慢性非酒精性肝病的臨床模型（包括年齡、性別、種族、體重指數(shù)、收縮壓、糖尿病[在糖尿病模型中移除]、湯森貧困指數(shù)、吸煙、飲酒和低密度脂蛋白）基礎(chǔ)上，加入MASLD評分能顯著提升辨別和再分類指標（圖2D）。進一步調(diào)整谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和A1c后，慢性非酒精性肝病的發(fā)病模型也很穩(wěn)健。
圖2肝脂肪變性蛋白質(zhì)組評分的建立及其與臨床結(jié)果的關(guān)系
4、肝脂肪變性蛋白質(zhì)組的空間結(jié)構(gòu)
科學家們?yōu)榱烁玫乩斫獾鞍踪|(zhì)組分析中識別出的關(guān)鍵蛋白質(zhì)靶點在人體肝臟中的具體位置和分布情況，借助了已有的單細胞RNA測序數(shù)據(jù)和肝細胞圖譜的空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)，將CARDIA臨床蛋白質(zhì)組回歸中確定的蛋白質(zhì)與其在人類肝臟中的基因表達進行了映射。研究中涉及的樣本不僅包括了空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)，還包含了scRNA-seq數(shù)據(jù)。通過這些數(shù)據(jù)，科學家們能夠廣泛識別細胞類型，并根據(jù)其與人類肝臟內(nèi)肝臟脂肪變性的關(guān)系確定優(yōu)先靶點的空間分布。科學家們利用單基因表達量和綜合表達量評分（圖3）對在scRNA-seq和空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)集中表達的237個與脂肪變性相關(guān)的蛋白質(zhì)中的198個蛋白進行了表達譜分析。結(jié)果顯示，這一分析表明主要在肝細胞中觀察到的受牽連靶點的細胞特異性表達模式占主導地位，同時在成纖維細胞、膽管細胞、內(nèi)皮細胞和免疫細胞等多種類型的細胞中都發(fā)現(xiàn)了靶點的表達（圖3A）。通過綜合表達評分，科學家們還發(fā)現(xiàn)，在脂肪變性組織內(nèi)和肝臟中軸區(qū)，相關(guān)靶點的基因活性較高。先前的研究也指出，在該數(shù)據(jù)集中的這些區(qū)域與較高的肝細胞表達特征相對應（圖3B-3F）。
圖3肝脂肪變性蛋白質(zhì)組的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)
接著，科學家們利用空間轉(zhuǎn)錄組學來檢測蛋白質(zhì)組學確定的相關(guān)靶點是否會在肝組織中表現(xiàn)出差異表達。通過分析，他們發(fā)現(xiàn)，在空間轉(zhuǎn)錄組學數(shù)據(jù)中，與脂肪變性相關(guān)的198個蛋白-基因中，有33個基因在健康組織和脂肪變性組織之間表現(xiàn)出顯著的差異表達（最小表達量>10%，經(jīng)假發(fā)現(xiàn)率[FDR]調(diào)整后p < 0.05；|log2折合變化|>0.25；以及最小表達量%點差異>10%；圖3H）。在這33個基因中，有30個基因在脂肪變性組織中表達量增加，3個基因（IGFBP2、IL1RAP和SHBG）表達量減少。這些基因在有無脂肪變性的肝臟組織中的呈現(xiàn)出不同的表達模式（圖 3H）。此外，研究還顯示，在人類肝臟中，脂肪區(qū)與非脂肪區(qū)域之間的RNA表達差異與CARDIA研究中循環(huán)蛋白的臨床效應大小之間存在生物學方向上的一致性（圖3G）。具體來說，CARDIA回歸系數(shù)越大，表明健康肝臟區(qū)與脂肪肝區(qū)的蛋白表達差異越大；脂肪變性程度越低，組織RNA表達量越高。
隨后，科學家們將這33個差異表達基因與NASH-CRN定義的肝臟脂肪變性階段的大量轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了比對分析，以研究隨著組織病理學表型嚴重程度逐漸增加的個體的潛在動態(tài)變化（圖4）。研究涉及了499名患有MASLD并接受了活檢的SteatoSITE參與者（其中47%為女性，中位年齡53歲，中位體重指數(shù)31 kg/m2，31%患有糖尿病）與34份對照樣本進行了比較。研究發(fā)現(xiàn)，在這33個基因中，有12個基因在所有脂肪變性階段都沒有顯著的表達差異，因此這些基因沒有被包含在最終的可視化分析圖（圖4）中。科學家們在研究脂肪變性時發(fā)現(xiàn)，不同的基因在不同脂肪變性等級中的影響程度有顯著差異，并且這些發(fā)現(xiàn)與循環(huán)蛋白組學和空間關(guān)系的研究結(jié)果是一致的。例如，IGFBP2、IL1RAP、SHBG、ENO3、DEGB1和ME1，某些基因在不同纖維化階段也表現(xiàn)出一致性。然而，在蛋白質(zhì)組和空間研究中，科學家們發(fā)現(xiàn)了兩大類不一致的現(xiàn)象：一種是某些基因的表達方向與蛋白質(zhì)組空間轉(zhuǎn)錄結(jié)果一致，但與總體轉(zhuǎn)錄結(jié)果不一致（如SERPINE1/PAI-143,44,45和HSPA1B46）；另一種是基因的表達方向與總體轉(zhuǎn)錄結(jié)果一致，但與蛋白質(zhì)組空間轉(zhuǎn)錄結(jié)果不一致（如 PSAT1,47 UDGH,23和 ACO148）。造成這些差異的因素可能包括：技術(shù)因素（測序方法、體細胞與單細胞、先前發(fā)表的scRNA-seq數(shù)據(jù)集樣本量有限）、參與者水平和生物學因素（脂肪變性是MASLD表型的一個組成部分，此外還有炎癥、氣球化和纖維化）。盡管存在這些不一致，這些研究結(jié)果還是顯示了蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄靶標圖譜在人類MASLD中的重要性，而正確繪制這一圖譜需要考慮到上下文的異質(zhì)性以及多種方法整合的復雜性。
圖4不同脂肪變性階段人類肝臟空間靶點的轉(zhuǎn)錄異質(zhì)性
科學家們?yōu)榱蓑炞C不同肝細胞中脂肪變性相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化與MASLD蛋白體組的直接關(guān)聯(lián)，利用Emulate器官芯片技術(shù)構(gòu)建了一個人源化脂肪變性肝臟芯片模型。肝臟芯片研究的實驗設(shè)計如圖5A和5B所示。通過這個模型，他們能夠在體外模擬肝臟組織的環(huán)境，并觀察脂肪變性對肝臟的影響。在給予能夠引起脂肪變性表型的脂肪酸（油酸和棕櫚酸）后，通過顯微鏡觀察、免疫熒光分析和基因表達等方法進行研究，結(jié)果表明，與形態(tài)學和轉(zhuǎn)錄組學誘導的MASLD表型一致（IRS1、50、51IRS2、51和PPARa52、53減少；SREBP1c、54 PPARg、55和FABP456增加；圖5C和5D）。由于單個肝臟芯片實驗中產(chǎn)生的cDNA產(chǎn)量有限，為了更有效地進行研究，他們從先前的蛋白質(zhì)組學和空間轉(zhuǎn)錄組學研究中識別出的33個潛在的靶標中，挑選出了13個靶標，進行進一步的評估。這些靶標被評估的方式有兩種：（1）選取了5個在脂肪變性過程中表達上調(diào)最顯著的靶點（HMGCS1、SERPINE1、HSPA1B、ENO3和HSPA1A），以及全部3個在脂肪變性中下調(diào)的靶點（IL1RAP、SHBG和IGFBP2），再加上空間轉(zhuǎn)錄組學分析中顯示在脂肪變性中上調(diào)幅度最小的2個靶點（CDA和PYGL）；（2）另外三個靶標雖然在人類肝臟空間研究中表達存在差異，但在非實質(zhì)性（非肝細胞）細胞（NPCs）中表達顯著；它們是ME1、CTSZ和DEFB1。此外，科學家們還檢測了兩個肝細胞特異性靶標，這兩個靶標是從CARDIA中與肝臟脂肪變性相關(guān)的循環(huán)蛋白質(zhì)組中篩選出來的（ACY1和AKR1C4），且與脂肪變性緊密相關(guān)，并且作為分泌蛋白具有很高的可信度。
圖5肝臟芯片上研究MASLD
在循環(huán)蛋白質(zhì)組、組織轉(zhuǎn)錄和肝臟芯片實驗中，科學家們觀察到了一致的結(jié)果：與肝臟脂質(zhì)代謝、應激反應和非經(jīng)典通路（例如鐵代謝異常）相關(guān)的基因（包括PYGL、HMGCS1、SERPINE1、ENO3和HSPA1B；圖5E）在肝細胞和/或非實質(zhì)細胞（NPC）中的表達有所增加。盡管在肝臟芯片實驗中，ME1、CSTZ和DEFB1在肝臟芯片的肝細胞中未見表達（與轉(zhuǎn)錄組研究一致），但它們在肝臟芯片的NPC中表達卻有所增加（圖5E）。這些發(fā)現(xiàn)與批量轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)中DEFB1和ME1的批量數(shù)據(jù)（圖4）結(jié)果表明：這些基因表達水平的增加可能是由非肝細胞來源的細胞所引起的。
為了評估在肝臟芯片上誘導脂肪變性是否會導致這些靶標在蛋白質(zhì)水平上的表達增加，科學家們隨后測量了在肝臟芯片上唯一可接觸到的肝細胞和NPC流出物中的靶標。他們選擇了在肝臟芯片實驗中15個在肝細胞中mRNA水平差異表達基因中的7個，這些基因具有細胞外分泌的高可信度細胞蛋白靶點，并且具有可用于評估肝臟芯片實驗流出物的商業(yè)ELISA試劑盒（HMGCS1、SERPINE1、PYGL、CTSZ、DEFB1、ACY1和AKR1C4；圖5）�？茖W家們注意到，在肝臟芯片的細胞流出物中，HMGCS1、SERPINE1、CTSZ、DEFB1、PYGL、ACY1和 AKR1C4的蛋白質(zhì)水平表達一致（圖5F），這表明細胞類型特異性蛋白質(zhì)分泌與肝臟芯片上的轉(zhuǎn)錄變化和群體水平的蛋白質(zhì)組方向性相匹配。有趣的是，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中非肝細胞特異基因編碼的分泌蛋白（并在科學家們的肝臟芯片數(shù)據(jù)中的mRNA表達水平上得到驗證）僅在非肝細胞的流出液中檢測到（CTSZ和DEFB1）。相反，僅在肝細胞通道中檢測到肝細胞特異性蛋白（ACY1和AKR1C4）。
肝脂肪變性是多系統(tǒng)代謝功能障礙的核心表型，隨著肥胖癥的流行而日益嚴重�？茖W家們采用一種綜合臨床表型、循環(huán)蛋白質(zhì)組學和組織轉(zhuǎn)錄組學的轉(zhuǎn)化策略，來尋找可以反映肝脂肪變性的動態(tài)功能的生物標志物。他們利用多模態(tài)成像和廣泛的蛋白質(zhì)組分析，鑒別出與肝臟脂肪變性進展有關(guān)的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)主要由在人類肝臟中轉(zhuǎn)錄水平豐富的基因編碼。在空間轉(zhuǎn)錄組學研究中，這些轉(zhuǎn)錄本在不同的脂肪變性區(qū)域有不同的表達模式，其中一些在脂肪變性階段是動態(tài)的。脂肪變性的循環(huán)多蛋白特征與脂肪肝和多系統(tǒng)代謝結(jié)果密切相關(guān)。科學家們利用人源化肝臟芯片模型誘導肝脂肪變性，驗證了優(yōu)先靶點的細胞特異性表達。這些發(fā)現(xiàn)凸顯了該方法在評估人類肝臟的預后、功能以及動態(tài)“液體活檢 ”方面的實用性，為尋找新的生物標志物和機理研究開辟了新的途徑提供新思路。
